自2010版藥典開始，每五年一次的藥典升級都對微生物檢驗的要求上一個臺階，留在記憶里的2015版藥典升級前的那些日子仍舊歷歷在目，讓我們在2020版藥典升級前回顧一下2015版升級前的那些點滴，以準備迎接即將到來的2020版。

【備注】

以下文章為2015年編寫，僅為了拋磚引玉。

1、自查2015版是否做到位做扎實；

2、其中有些應對方法（該方法指的是管理和應對策略）可對2020版的升級準備有所啟發和借鑒。

ROUND 5

2015版中國藥典微生物項變化的應對策略—設備（一）

依據以下條款，15版藥典微生物項對設備方面的挑戰大的是以下2大設備：無菌檢查用隔離器（若企業決定使用B+A請自動忽略）和微生物鑒定系統，余下就是已有設備的增減，如培養箱、生物安全柜、超凈臺等。

1、《9203 藥品微生物實驗室質量管理指導原則》中“環境”項下的提到“微生物實驗的各項工作應在專屬的區域進行，以降低交叉污染、假陽性結果和假陰性結果出現的風險。無菌檢查應在B級背景下的*單向流潔凈區域或隔離器系統中進行，微生物限度檢查應在不低于D級背景下的B級單向流空氣區域內進行。*和B級區域的空氣供給應通過終端高效空氣過濾器（HEPA）”。

2、《9206 無菌檢查用隔離系統驗證指導原則》

3、《9205 藥品潔凈實驗室微生物監測和控制指導原則》中“5.微生物鑒定”中提到“建議對受控環境收集到的微生物進行適當水平的鑒定，微生物菌群信息有助于預期常見菌群，并有助于評估清潔/消毒規程、方法、清潔/消毒劑及微生物監測方法的有效性，尤其當超過監測限度時，微生物鑒定信息有助于污染源的調查。關鍵區域分離到的菌落應先于非關鍵區域進行鑒定。”

4、《9204 微生物鑒定指導原則》

5、《1101 無菌檢查法》、《1105 非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法》、《1106 非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法》中霉菌及酵母菌的復蘇及供試品培養溫度及控制菌的培養溫度有所變化。

一、 無菌檢查用隔離器

國內現在使用隔離器用作無菌檢查的企業還是很少的，我們是12年進行的隔離器招標，當時使用的企業更少，當時我是個27歲的女孩子，對于設備的了解大家也可想而知，硬著頭皮打了很多電話去各個企業和藥檢所咨詢品牌和使用情況，上海地區也是*的幾家企業有，因為預算的關系終選定國產廠家的雙人四手套的單面硬體層流式的隔離器。

這里我確實有話要說，而且是發自肺腑的，我想很多企業設備部的老大都會說這種東西又沒有什么技術含量，就幾塊鐵皮拼拼起來要那么貴嗎？但是實際使用和溝通下來，無菌檢查用的隔離器真的有別于生產線上的隔離系統，它的細節設計會決定無菌檢查實驗的成功率，做過無菌檢查的人都知道，很多供試品的操作和在套筒上的操作是需要精細化的，這就和生產線上很大程度上區分開來，所以隔離器的前期調研和設計太重要了！這里我不得不提一句，如果企業預算足夠的話，我個人建議購買國外品牌的隔離器，當然這個品牌在隔離器的生產特別是無菌檢查隔離器的生產方面要有一定經驗，這樣對客戶要求的理解、設備的定制設計、后續的驗證、實際使用時碰到的問題和定期維保等都會有非常大的幫助，而且其驗證的工程師等都非常有經驗，連客戶大裝載的在隔離器內的擺設位置等都給你設計好并且是有理有據的。我有一次邀請一位國外的隔離器生產廠家的銷售人員來我們公司針對我們使用的隔離器聊了一個多小時，真的深有感觸，他能把很多技術問題解釋得很清楚，這點來說國內真的還有很長的一段路要走，因為外觀很容易模仿而且非常容易做的很漂亮，但是設計的細節和人員的技術能力相信還是需要些年頭的，希望國內的生產企業能夠加快步伐。

基本現在市面上的無菌檢查用隔離器都是定制款，因為要根據客戶的一次大檢驗量等需求進行設計和定制，當時我們在設計要求方面因為經驗不足確實留下了一些后續工作，雖然都能處理，但是個人覺得還是有不盡如人意的地方。以下就我的個人經驗，選幾個比較重要的點討論一下：

1、 放置環境

《9206 無菌檢查用隔離系統驗證指導原則》中寫到“無菌檢查用隔離器安裝環境的潔凈度要求建議不低于我國現行GMP中D級空氣潔凈度要求”。

首先得考慮隔離器放置的環境是否能夠滿足該臺隔離器（如有需要配備傳遞艙也一并考慮）的放置，應保證安裝地點周圍有足夠空間，至少滿足正常物品的傳送以及一些正常維保維護的需要。如果使用集成的滅菌設備，已經集成在隔離器內部那問題不大，若使用移動式的必須考慮其放置位置；如果內部接入在線粒子和在線浮游探頭進行檢測，應考慮外置設備的放置位置；如果隔離器設置穩壓電源，則應考慮穩壓電源的放置位置，盡量以保證隔離器正常運行但是不占用室內空間為原則，事先應進行考慮和設計布置。

若放置在潔凈區中，如果隔離器是室內采風，那潔凈室的HEPA設置在什么位置，其風量多大能夠保證隔離器和潔凈室內都能夠維持要求的潔凈水平，隔離器的放置位置不能正對下風口且不能擋住出風口，應盡可能少的影響室內氣流走向。

若放置在非潔凈區，必須考慮房間溫濕度的控制，如過氧化氫的滅菌會依賴室內采風的室內溫濕度。

若隔離器需要接入壓縮空氣（密封圈密封、氣動閘等）或水（清潔腔體）等介質，則需要考慮放置環境是否需排布相應的管道以滿足需要。

2、 材質

現在市面上基本接觸到的有三種：不銹鋼、硬質塑料和軟質塑料，前兩種即所謂硬艙體，后一種是軟艙體，第二種硬質塑料曾經接觸過一家國外的廠家使用的，樣機的照片非常可愛（女同胞們會比較喜歡），是標準化的配制加組合式的銷售。硬體和軟體其實各有特點，硬體一般艙內會選用316不銹鋼，艙外會選用304不銹鋼，軟體一般為無毒PVC（聚氯乙烯）材質（應注意厚度）。

軟體的優勢在于視覺觀察范圍及清晰度優于硬體，但是時間久了膜容易老化需要定期更換整個膜體；人員手部的活動不像硬體那么受限，可以更好的拿取艙體內物品，操作更舒適；價格優勢也是非常重要之一。

硬體的密封性相較于軟體有一定優勢，若腔體內使用尖銳物品不慎可能不需要擔心是否會破壞艙體的密封性；另外硬體的清潔較軟體的好進行，畢竟軟體清潔時支撐點可能無硬體那么實感；再者硬體的視覺及使用感官上較軟體來的扎實，可能這個屬于中國人的傳統觀念。

其實主要還是看各個企業自己的實際需要和預算的水平。

3、 空氣處理系統

這個在指導原則中講的已經比較清楚了，無論是層流還是湍流都是要保證，在靜態時，隔離器內部環境的潔凈度要達到現行GMP中*的要求，因在操作過程中可能會產生顆粒，所以在動態時未做要求，同時對空氣速率和換氣次數也未作要求。

在使用殺菌劑滅菌時，隔離器需密封嚴實以確保泄入周圍環境的揮發劑或氣體維持在相當低的水平，當與外界環境想通的門被打開時（即滅菌完畢通風時），隔離器內部必須維持正壓以保證無菌環境不被污染。

通常情況下，隔離器一般對周圍環境應維持正壓，正常操作時，壓差范圍為20-50Pa（USP1208規定：壓差一般在20Pa或以上，使用時壓力不得超過廠家建議的限值），這里為什么要提一下，因為有些國內的隔離器廠家可能沒有對藥典的要求那么關注，所以大家一定在前期把這個要求提出來，在后階段的驗證時，壓差是一個很重要的關注點。

4、 儀器儀表

這里我僅列舉大家常用的進行探討，各自實驗可能需要的其他儀器儀表就按各自需求進行評估購買。

1）、儀器

置于隔離器內的儀器基本就是滅菌設備、集菌儀、浮游菌探頭、粒子探頭、手套檢漏儀。

現在很多的隔離器都是選用過氧化氫滅菌的，也不排除有使用臭氧和過氧乙酸滅菌的，設備可以集成在隔離器內部，也可以使用分體式的，這種分體式的也可以用來進行潔凈室滅菌，當然滅菌要考慮潔凈室大小。過氧化氫的滅菌技術我在這里就不作說明了，各家有各家的特點，但一定要注意的是腔體內溫濕度的控制還有就是滅菌氣體發生器的進氣與排氣的管路的在設備運行時的開閉。

集菌儀基本都會在購買隔離器的同時進行合并購買，并讓廠家做在隔離器內部進行使用，那集菌儀放置的位置就相當重要，若一人操作，集菌儀可能就放在中間，若雙人操作，集菌儀可能放置在主操手的位置，這點是非常關鍵的，直接影響實驗人員的使用感受（人家操作的不舒服實驗的質量就一并打折扣），在設計時就應該好好考慮，同時應考慮操作人員手的長度是否夠得到集菌儀上的關鍵操作位置，還有非常非常重要的一點！就是集菌儀的排水口設計在哪里？這點其實相當的重要也需要進行實際測量。如果隔離器的下水口和集菌儀排液的管口是使用硅膠管連接的，那硅膠管如果有一定的彎曲死角，供試品實驗時排水就會不暢，廢液累積在排液槽一方面上端排液有問題，另一方面若排液槽內有微生物那因為廢液的液面高度可能會污染套筒底部。所以集菌儀不單是那么簡單的嵌入隔離器內部即可，其一些配套原件的設計位置也是需要重點考慮的。這里再額外提一下排水的問題，因為排水的問題會導致隔離器內腔與外部會有一個孔，那有很多人可能就會想到密封性的問題，這里我咨詢過一個外企用了7、8年隔離器的公司，他們是這么解決的，我們隔離器后續也借鑒他們的使用方法，一般隔離器的使用流程是密封性測試→滅菌通風→實驗操作，在開啟隔離器運行之前，就將隔離器下端的排水孔上的硅膠管與排液桶相連，排液桶使用的是可滅菌PP材質，桶的蓋子是懸口的，上面打兩個孔，讓其變成一個二通蓋子，A通連接呼吸器，B通連接從隔離器下端排水孔連接下來的硅膠管，在使用前將桶蓋蓋好，B通的硅膠管頂部用牛皮紙或錫箔紙包好，整個桶進行滅菌，滅菌完畢將B通的硅膠管與隔離器下水孔連接，并將B通的硅膠管夾住封閉。操作好上述步驟即進行隔離器的運行步驟，進入可實驗操作的階段，將B通的硅膠管放開進行排液，這樣操作對于密封測試及滅菌步驟均無影響，且正常實驗時艙體為正壓，且排液桶已經過滅菌，降低外接物品對艙體的影響。

對于環境檢測的設備，浮游菌和粒子的探頭也是需要考慮布置在何處的，這個必須經評估得出，如果預算有限，無法配制相應的監測設備，則在隔離器的設計時可以先預留至少三個外接口以備后續使用。當然也必須通過其他手段在實驗中監控微生物，如放置沉降碟、表面微生物或擦拭取樣等。

手套檢漏儀這個設備我個人覺得沒有很大意義，檢測原理和腔體內的密封性測試一樣，反正我們當初也買了，也就是定期檢測下手套，指導原則也推薦了微生物的檢測方法就是手套浸入0.1%的蛋白胨水然后薄膜過濾，大家可以根據需要選擇是否購買。

2）儀表

隔離器作為無菌實驗環境的保證，其需要控制的參數不少，那儀表就是非常重要的一個輸出工具，壓力表、溫濕度探頭、風速探頭、滅菌劑的高低濃度探頭等。

我們隔離器經過一次運行，我們關注的參數有壓力、溫濕度、風速和過氧化氫高低濃度。溫濕度探頭位于操作艙體內用于監測艙體溫度及濕度；風速探頭位于操作艙內的高效過濾器下端，用于監測艙體風速（我們是層流式的）；過氧化氫高濃度探頭位于操作艙內過氧化氫噴淋頭邊，用于監測滅菌時艙體內過氧化氫濃度；過氧化氫低濃度探頭位于設備出風口處，用于監測過氧化氫排空濃度，當該濃度＜1ppm時，設備自動進入生產模式，即可進行實驗操作；以上4個探頭在設備運行過程中均可實時監控并可打印數據曲線。

在指導原則上明確表示“需對隔離器的儀器儀表，比如過氧化氫傳感器、溫濕度傳感器、壓力傳感器等進行定期校驗”，其實這里我也有個困惑，就是過氧化氫傳感器，現在計量院沒辦法進行校驗，要送到國外去原廠校驗，而且這個傳感器又是比較重要的，要么企業自備2個傳感器，要么和供應商商量讓其常備在校驗有效期內的傳感器，不知道大家是如何解決的。

5、軟件

隔離器的軟件相當重要，這是體會的一點，FAT前就必須和廠家詳細溝通，程序如何控制，程序運行的穩定性，程序運行時需監控的參數以及運行完畢后可打印的報告及曲線等，目的就是確認供應商能將自己想實現的東西在軟件上實現。我們在隔離器邊有一個觸摸屏可以控制和調閱參數，同時在普通房間也連接電腦可以實時監控隔離器運行時的情況，并在運行完畢后貯存一些電子數據。

6、隔離系統的驗證

這個真的是難講的一部分，在藥典的指導原則上也都是講一些原則性的東西，沒有特別細節的，大家其實可以參考USP1208，上面對于隔離器的3Q比CP稍微詳細一點，現就比較重要的2點和大家作個探討。

1） 滅菌參數的確認

一般驗證工程師會根據客戶的滿載量確定一個滅菌參數，如滅菌劑流量、是溫度控制還是時間控制、滅菌劑在腔體內的駐留時間等等，這里我們需要考慮的是，我們腔體內的滿載放置是否會影響到滅菌劑對腔體內各個外表面微生物的殺滅情況，其實內部物品（如支架、設備、手套）的放置位置都會影響到滅菌劑在腔體里的濃度分布，其實這個時候可以使用化學指示劑對可能難以殺滅的部位進行布點，化學指示劑使用起來比較方便，滅菌劑對微生物殺滅幾個log，其色卡就會相應有所變化。

當然化學指示劑可以作為參考，終定性的還是生物指示劑，生物指示劑應使用滅菌劑相應的挑戰菌株進行試驗，如過氧化氫滅菌劑，在藥典的滅菌法中明確使用嗜熱脂肪芽孢桿菌進行挑戰，在使用前至少應確認其孢子含量是否達標，對于D值現在藥典還未規定（聽說正式版在推進這個事情，后續還結果不清楚），但在一些外企已規定需要測定D值。生物指示劑在腔體內的擺放位置很有講究，一些未成功滅菌的點可能是因為指示劑擺放有誤造成，一般指示劑的外包裝是Tyvek，里面含濾紙片或不銹鋼片，因濾紙片可能會吸收滅菌劑導致有一定殘留，一般推薦使用不銹鋼片。當在隔離器中放置時，印有字體的一面應朝向氣流，不能阻塞該面，理想上，其放置位置應能讓氣流經過Tyvek的兩面；在使用Tyvek包裝時，應注意使用膠布固定時不要遮蓋Tyvek的表面，否則會阻礙氣流；避免在Tyvek表面標記（因某些類型的筆墨會催化過氧化氫），通常應標記在膠布上；有些指示劑有僅需培養24h的，但還是建議培養時間滿足7天，避免假陰性結果。在這里必須提一句的是，大家一定要篩選質量合格可靠的生物指示劑，供應商或者代理商的專業程度也是相當重要的，國外有些指示劑商品也真的不怎樣，前期的孢子含量測定等非常重要，要用數據說話！

滅菌確認符合要求后，滅菌報告的監控數據必須設置一定的合格范圍以便日常使用時確認滅菌效果，如滅菌劑注入流量、溫濕度、滅菌濃度、計算滅菌劑使用量等，這個是按各企業的滅菌劑不同及滅菌劑量時間的不同進行確認。

2） 包裝完整性測試

這里的包裝完整性測試的前提必須包括里面物品能承受的大滅菌次數以及在腔體內的holding time。舉個例子，如果物品置于腔體內滅菌，不進行大滅菌次數的測試，則里面的物品僅可使用一次，測試完畢，不管用過或未使用的物品均需處理不可進行二次使用。做這個驗證需要考慮，可能腔體內樣品可承受的大滅菌次數，一般為2次，另外滅菌完畢后的holding time是多久，比如今天滅菌實驗是第二天做，那就必須考慮樣品及其他物品在腔體內的存放時間。設計好大滅菌次數及holding time后，根據滅菌參數對腔體內物品滅菌2次后放置估計的長時間，然后再進行包裝完整性測試，測試通過后，今后使用時，內部物品經滅菌2次后必須處理不得使用（即滅菌1次還可使用），物品滅菌完畢后在腔體內的存放時間不得大于驗證的holding time。

基本置于隔離器內的物品在之前應進行評估是否密封以防止滅菌劑的侵入，但有些物品可能沒有使用的先例，需要進行挑戰實驗，在挑戰之前，有一個小方法可能可以輔助確定是否有過氧化氫滲入，這個方法我沒有用過，也是比較老師培訓時推薦的，大家有興趣可以試用下，比較簡單易行，但后續的滲入確認還是需要傳統微生物的方法進行挑戰，如使用新的瓶子，可以在里面裝入WFI，進行滅菌前后pH的測試，若下降則說明有一定滲入。

包裝完整性測試指導原則上明確注明參照1101無菌檢查法進行，進行無菌實驗的供試品、稀釋液、沖洗液、培養基、套筒，經滅菌后按無菌檢查方法制成供試品管，按規定培養基的挑戰菌制備定量的新鮮菌液接入供試品管即可，我們是在制備好供試品管后在陽性室接入陽性菌的，也有企業直接將在沖洗液中加入定量的新鮮菌液，經隔離器滅菌及holding time后直接按無菌檢查方法接入供試品管中，這樣挑戰更大，但是若菌株不生長，可能無法判斷是否是因為菌株經過滅菌及存放時間后死亡還是滅菌劑滲入導致的問題，當時接入的量也必須同步確認。

在隔離器內使用的平板等，盡管平板廠家可能提供相應的防止過氧化氫等一些滅菌劑滲入的證明報告，但是其驗證時的劑量和時間和實際使用自己隔離器的劑量和時間不一致，所以我們必須還是要確認，這個也可以使用促生長實驗進行滅菌前后的確認。

無菌檢查用隔離器的篩選、驗證及日常使用維護等其實是非常繁瑣的過程，如果有新的包裝或檢品進行無菌檢查必須進行包裝完整性測試進行確認，若未配套傳遞裝置，其滿載量必須考慮的非常周全，對于隔離器的使用我也是新人，所以該篇文章僅描述我們實驗室的使用情況和一些經驗，大家可挑選相關內容作為參考并結合各自企業特點進行隔離器的篩選及管理。